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擴增子測序技術介紹
***************************************************************************************************** 技術簡介： 擴增子測序就是通過對基因組目的區(qū)域進行PCR擴增，將目標區(qū)域DNA擴增富集后進行高通量測序的研究策略。目前擴增子測序服務主要包括細菌16SrDNA區(qū)/真菌ITS1區(qū)/真菌ITS2區(qū)/真菌18SrDNA區(qū)測序以及后續(xù)的數(shù)據(jù)分析工作，可有效研究特定環(huán)境中的物種信息，包括：物種差異、物種分類、物種豐度，對復雜環(huán)境中的微生物構成研究有重要的指導作用。 16S rDNA測序 : 16SrRNA為核糖體的RNA的一個亞基，16SrDNA就是編碼該亞基的基因，存在于所有細菌基因組。16S rDNA大小適中，約1.5Kb左右，同時具有高度的保守性和特異性。16S rDNA既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術較容易地得到其序列，目前已被廣泛用于病原菌的檢測和鑒定。 18S rDNA測序 : 18S rDNA為編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列。在結構上分為保守區(qū)和高變區(qū)，保守區(qū)反映生物物種間的親緣關系，高變區(qū)反映物種間的差異。 ITS 測序: 在真核生物中，18S rDNA和28S rDNA轉錄間隔序列稱為ITS區(qū)。ITS分為兩個區(qū)域：ITS1/ITS2，ITS1位于18S和5.8S之間，ITS2位于5.8S和28S之間。ITS由于是非轉錄區(qū)，承受的選擇壓力較小，變異強，目前已廣泛用于真菌分類鑒定。 功能基因測序: 功能微生物是在自然界中由于其功能的重要性而受到廣泛關注的一類微生物，如硝化細菌、反硝化菌、氨氧化細菌、硫酸鹽還原菌、固氮菌、固氮菌等。每種功能微生物在分類學上可能有很大不同，但卻具有相類似的基因使其能夠發(fā)揮同樣的功能，因此使這些功能細菌發(fā)揮這種特定功能的基因就稱為功能基因，如nxrA、nirS/nirK、amoA、dsrB、nifH、nifH。功能基因測序就是針對這些功能基因設計PCR通用引物，進行建庫高通量測序。 應用領域:
技術優(yōu)勢
技術參數(shù)與實驗流程
***************************************************************************************************** 技術參數(shù)
實驗流程：
經(jīng)典文章解讀
***************************************************************************************************** 案例1：人類，動物對南極無冰土壤地區(qū)微生物群落結構的影響 背景：南極具有世界上最極端的環(huán)境，這些極端環(huán)境只支持相對簡單的生態(tài)系統(tǒng)，因此南極生態(tài)系統(tǒng)對外部干擾（如氣候變暖或人活動）特別敏感。土壤微生物群落是土壤養(yǎng)分循環(huán)系統(tǒng)的主要驅動因素，它特別容易受到無冰地區(qū)的外部干擾，例如企鵝、海豹。隨著最近幾十年氣候的變暖，冰川融化，出現(xiàn)了新的無冰地區(qū)，因此企鵝、海豹數(shù)量增多，同時人類在無冰地區(qū)的活動也會對生態(tài)系統(tǒng)造成影響，這些活動都會改變土壤微生物群落結構，因此很需要了解人類，動物對南極無冰地區(qū)土壤微生物群落結構的影響。 方法：為了解人類，動物對南極無冰土壤地區(qū)微生物群落的影響，對南極洲菲爾德斯地區(qū)的4種不同土壤樣品（人類、企鵝、海豹影響土壤和原始土壤）進行針對16S rRNA rRNA V3高變區(qū)的擴增子測序。 結果：4種土壤樣品的地球化學性質和細菌群落結構存在顯著差異，在這些樣品中分別鑒定出數(shù)量不同的OUTs（3503 to 4536）；細菌多樣性由多到少分別是企鵝影響土壤、原始土壤、人類影響土壤、海豹影響土壤。 變形菌，放線菌，酸桿菌，疣微菌存在于所有這4種土壤樣品。在變形菌中豐度最高的是Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria，在放線菌中豐度最高的是放線菌亞綱。 基于距離的冗余分析顯示，PH值、磷、有機碳、有機氮是與土壤細菌群落分布的最重要的相關因素。 OTU聚類分析顯示，12個土壤樣品被分為4組，對應于4種土壤類型。 維恩圖顯示4種土壤類型中細菌的OUT有所差異，例如地點特異的OUT數(shù)目變化很大，從海豹影響土壤（3685）到人類影響土壤（5589），只有927個細菌OUT是這四種類型土壤所共有的。 對土壤中50個主要OTUs進行熱圖和網(wǎng)絡圖分析，結果表明占據(jù)主導地位的50個OTUs在四種類型土壤中的豐度不同并且在每種類型土壤中占據(jù)主導地位的OTU也不同。 參考文獻：Wang NF et al. Diversity and structure of soil bacterial communities in the Fildes Region (maritime Antarctica) as revealed by 454 pyrosequencing[J]. Front. Microbiol, 2015, 6:1188. 
圖一：(A）南極洲菲爾德斯地區(qū)4個樣品采集地區(qū)；(B）受人類群體影響的地點（W2）；（C）受海豹影響的地點（36）；（D）受企鵝群體影響的地點（Q11）；（E）原始土壤地點（A1）。
圖二：12個土壤樣品中細菌群落基于OTU的聚類分析
圖三：.維恩圖顯示在4種土壤類型中細菌OTU重疊的程度（在3%的進化距離）
圖四：（A）4種類型土壤50個主要的OTUs的heatmap圖；（B）4種類型土壤50個主要的OTUs的網(wǎng)狀圖
案例2：人類孕期微生物群落多樣性或提示早產(chǎn)風險因素背景：早產(chǎn)發(fā)生在懷孕37周之前，是新生兒死亡的重要原因之一，它折磨著全世界11%的孕婦。20%的早產(chǎn)發(fā)生與羊膜腔內(nèi)細菌定植有關，而母親的自身微生物群落是最有可能的羊膜腔內(nèi)細菌定植來源。美國斯坦福大學David Relman及其同事提出，懷孕階段的微生物群組成可能提示早產(chǎn)風險因素。 方法：研究者采取縱向案例對照研究，選取了49名18歲及以上的孕婦（其中15名孕婦發(fā)生早產(chǎn)），對孕婦每一周以及產(chǎn)后的陰道、大便、唾液和牙齒/牙齦的微生物群落進行了采樣。 結果：通過焦磷酸測序和illumina測序平臺對微生物DNA16S rDNA擴增子測序，結果發(fā)現(xiàn)在整個懷孕期間4種組織來源微生物群組成和多樣性大致保持穩(wěn)定；多數(shù)女性在分娩之后發(fā)生微生物群組急劇而持久的變化，主要表現(xiàn)在乳酸桿菌水平降低以及多種厭氧菌的出現(xiàn)；陰道微生物群落分析表明存在5個主要微生物群落組成，其中4個群落都以乳酸桿菌為優(yōu)勢物種，且為不同的乳酸桿菌類型。第5個群落類型缺乏乳酸桿菌，但是菌種多樣性很豐富；對于某些陰道微生群缺乏乳酸桿菌的女性，加德納菌和脲原體的豐富程度與早產(chǎn)有關聯(lián)。以上結果提示，懷孕早期階段的微生物群落多樣性可能為早產(chǎn)風險提供線索，并且可能影響產(chǎn)后母親和嬰兒的健康。 參考文獻：Digiulio D B, Callahan B J, Mcmurdie P J, et al. Temporal and spatial variation of the human microbiota during pregnancy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, 112. 
圖一：懷孕期間4種組織來源微生物群組成和多樣性大致保持穩(wěn)定
圖二：40例孕期女性陰道微生物縱向多樣性分析獲得5個主要微生物群落組成(CST)。1，2，3，5這四個群落都以乳酸桿菌為優(yōu)勢物種，且為不同的乳酸桿菌類型。CST 4群落類型缺乏乳酸桿菌，但是菌種多樣性很豐富.
圖三：（A）CST 4群落微生物多樣性豐度程度與早產(chǎn)呈正相關；（B）CST4樣本所屬孕婦在任一孕期發(fā)生早產(chǎn)的比例都是最高的。
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