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英文題目：Copy Number Variation of Cytokinin Oxidase Gene Tackx4 Associated with Grain Weight and Chlorophyll Content of Flag Leaf in Common Wheat 期刊名：PLOS ONE 發(fā)表日期: 2015年12月 研究背景： 光合作用對(duì)食品和纖維生產(chǎn)是至關(guān)重要的，約70–90%的糧食生產(chǎn)來(lái)源于灌漿期的光合作用產(chǎn)物。在高等植物葉片中，葉綠素是葉綠體的主要光合色素，它的含量直接影響植物光合作用效率，從而影響作物產(chǎn)量。因此了解葉綠素生物合成和控制葉綠素含量的遺傳機(jī)制對(duì)改善作物產(chǎn)量至關(guān)重要。研究表明植物激素細(xì)胞分裂素（CTK）能夠顯著增加葉片葉綠素含量，葉綠體穩(wěn)定性和凈光合速率。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因（IPT）過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株通常表現(xiàn)出持續(xù)綠色的表型，這是因?yàn)槠潴w內(nèi)的細(xì)胞分裂素（CTK）含量很高。細(xì)胞分裂素氧化酶（CKX）可以使細(xì)胞分裂素水平不可逆失活，因此細(xì)胞分裂素氧化酶可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂素含量來(lái)調(diào)控葉綠素含量和光合作用，因此細(xì)胞分裂素氧化酶基因被認(rèn)為與葉綠素水平和穩(wěn)定性有緊密關(guān)系。目前很多研究關(guān)注細(xì)胞分裂素氧化酶基因與作物產(chǎn)量及其相關(guān)性狀的關(guān)系。在小麥中，7個(gè)Tackx基因被分離出來(lái)，包括染色體3A上的Tackx1；7A或7B上的Tackx2；3DS上的Tackx2.1 和Tackx2.2；3DS上的Tackx3，Tackx5和Tackx6；這些Tackx基因通常與小麥穗粒重或穗粒數(shù)相關(guān)，然而目前對(duì)于Tackx基因與葉綠素水平的關(guān)系還不清楚。因此本文想解決兩個(gè)問(wèn)題： （1）鑒定Tackx基因變異形式以及它們與粒重和葉綠素水平的關(guān)系； （2）驗(yàn)證Tackx基因?qū)αＶ睾腿~綠素水平的影響。 研究材料： 169株京411 ×紅芒春21的小麥重組自交系；102株小麥自然群體 研究性狀：小麥粒重；小麥開花5, 10, 15, 20, 25 天后旗葉葉綠素的含量 技術(shù)平臺(tái)： PCR 研究思路：
測(cè)量粒重和葉綠素水平 以169株京411 ×紅芒春21的小麥重組自交系為研究對(duì)象，其中京411四季的平均千粒重是46.2 g，而紅芒春21的平均千粒重是20.9 g。這兩個(gè)親本在產(chǎn)量，旗葉葉綠素含量和粒重方面具有明顯的差異，102株的小麥自然群體在旗葉葉綠素含量和粒重方面也有明顯的差異（Table 1）。
Table 1．親本和重組自交系（RIL）群體的葉綠素含量和粒重統(tǒng)計(jì)
a: C5, C10, C15, C20, C25分別代表開花5, 10, 15, 20, 25 天后旗葉葉綠素的含量; TGW:千粒重。
葉綠素含量和粒重的關(guān)聯(lián)性小麥重組自交系群體內(nèi)旗葉葉綠素含量和粒重表現(xiàn)出較大的波動(dòng)（Table 1）。開花后不同時(shí)期的葉綠素含量和粒重關(guān)聯(lián)性分析表明在小麥灌漿前期旗葉葉綠素含量對(duì)于粒重有明顯影響。 Tackx基因與葉綠素含量，粒重的關(guān)聯(lián)性 關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)在所有Tackx基因中Tackx4基因與旗葉葉綠素含量和粒重有明顯的關(guān)聯(lián)性（Table 2）。接著設(shè)計(jì)所有已分離Tackx基因的引物用來(lái)檢測(cè)它們的變異形式，結(jié)果在重組自交系群體中檢測(cè)到Tackx4基因有兩種表達(dá)模式：京411的基因型A和紅芒春211的基因型B（Fig 1），Tackx4基因的兩個(gè)片段表現(xiàn)出共分離。分析表明開花5-15天后攜帶基因型A個(gè)體的葉綠素含量和粒重要比攜帶基因型B個(gè)體的高（Table 2），這些結(jié)果說(shuō)明基因型A與葉綠素含量和粒重顯著關(guān)聯(lián)。 Table 2. 重組自交系群體內(nèi)Tackx4基因的兩種基因型與旗葉葉綠素含量和粒重關(guān)聯(lián)性分析  
Fig 1. Tackx4基因在京411 ×紅芒春21小麥重組自交系群體中的表達(dá)。 泳道1-17: 1,京411 ; 2,紅芒春21 ; 3,JH2; 4, JH17; 5, JH3; 6, JH11; 7, JH7; 8, JH15; 9, JH12; 10, JH13; 11, JH14; 12, JH20; 13, JH21; 14, JH19; 15, JH25; 16, JH26; 17, JH27。京411 和紅芒春21的基因型分別用A和B表示。. JH2, JH13, JH11, JH12等分別代表重組自交系的個(gè)體。
Tackx4基因的染色體定位以前的研究表明細(xì)胞分裂素氧化酶基因CKX屬于一個(gè)大的基因家族，主要分布在染色體3A, 3B, 3D, 7A, 7B上，本文使用中國(guó)春小麥缺體四體系把Tackx4定位到染色體上。使用引物T19-20在中國(guó)春小麥上檢測(cè)到兩個(gè)擴(kuò)增片段Tackx4-2和Tackx4-3（Fig 2）, 被定義為基因型C。而從N3AT3B, N3AT3D和山羊草（DD基因組） 中則不能擴(kuò)增出Tackx4基因 （Fig 2），說(shuō)明Tackx4基因在普通小麥的3A染色體上。這些結(jié)果也表明使用Tackx4基因引物T19-20至少能從普通小麥中擴(kuò)增出3個(gè)片段。 
Fig 2. 使用中國(guó)春小麥缺體四體系把Tackx4定位到染色體上。泳道1–14: 1, 京411; 2, 玉麥 8679;3, Yongchuanbaikemai （中國(guó)地方品種）; 4, 中國(guó)春小麥; 5, 永川白麥子（中國(guó)地方品種）; 6, Wanxianbaizi （中國(guó)地方品種）; 7,Heshangmai; 8, N3BT3A; 9, N3DT3A; 10, N3BT3D; 11, N3AT3D; 12, N3AT3B; 13,永麥158; 14, Y6 （山羊草, DD）. 基因型A（Tackx4-1和Tackx4-2）和基因型 C（Tackx4-2 和 Tackx4-3）分別用A和C表示。
Tackx4和基因特異標(biāo)記的連鎖分析為了分析Tackx4在染色體3A上的遺傳連鎖并進(jìn)一步評(píng)價(jià)它對(duì)葉綠素含量和粒重表型變異的作用，挑選了染色體3A上的49個(gè)SSR markers用來(lái)區(qū)分兩個(gè)親本（京411 和紅芒春21）以及兩個(gè)池（20個(gè)高得分RIL個(gè)體和20個(gè)低得分RIL個(gè)體）。49個(gè)SSR markers中，有13個(gè)SSR markers和T19-20都展現(xiàn)出多態(tài)性，并且位于同一個(gè)連鎖群（Fig 3）。結(jié)果鑒定到一個(gè)同時(shí)控制開花5-15天旗葉葉綠素含量和粒重的基因座位，位于染色體3A markers T19-20和wmc169之間 （Fig 3）。比對(duì)到Tackx4基因上的QTL可以解釋葉綠素含量和粒重8.9%-22.3%的變化（Table 3）。 
Fig 3. Tackx4基因在小麥染色體3A上的遺傳連鎖圖譜。4個(gè)框分別代表4個(gè)性狀 （C5, C10, C15, GW）。
Table 3葉綠素含量和粒重的QTL統(tǒng)計(jì)。
Tackx4變異形式和葉綠素含量，粒重的連鎖分析 為了進(jìn)一步確定Tackx4不同變異形式對(duì)葉綠素含量，粒重的作用效果，對(duì)小麥自然群體（102種）進(jìn)行了基因型鑒定，并分析了Tackx4基因型與粒重之間的關(guān)系。在這102個(gè)小麥品種中，有49種攜帶基因型A，15種攜帶基因型B，38種攜帶基因型C（Fig 4）。基因型和性狀的連鎖分析表明葉綠素含量（C5, C10, C15），粒重與基因型A呈正相關(guān)，但是與基因型B和C 呈負(fù)相關(guān)（Table 4）。
Table 4. Tackx4變異形式和葉綠素含量，粒重的連鎖分析
 對(duì)Tackx4-1, Tackx4-2, Tackx4-3 進(jìn)行測(cè)序分析。這3個(gè)片段與Tackx4（BM138354）（在本次研究中用于設(shè)計(jì)引物T19-20）有超過(guò)99%的同源性，并且片段相互之間也超過(guò)98%的同源（Figs 5, 6）。這些結(jié)果表明Tackx4（BM138354）實(shí)際上是這3個(gè)片段中的一個(gè)。Tackx4 三個(gè)拷貝的序列差異主要位于262bp -378bp的內(nèi)含子區(qū)域，它有明顯的內(nèi)含子-外顯子邊界序列“GT/AG”。在這個(gè)內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)8-bp的插入和一個(gè)“AAA-TTT”變異，另外在外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)SNP位點(diǎn)（Figs 5）。 
Fig 5. Tackx4-1, Tackx4-2, Tackx4-3, Tackx4b （BM138354）的序列比對(duì)
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