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題目：Carbon constrains fungal endophyte assemblages along the timberline (沿著樹帶界線碳約束的內(nèi)生真菌群落 )
期刊名： Environmental microbiology 發(fā)表時(shí)間：2015.7 IF：5.932 單位：南京中國科學(xué)院土壤科學(xué)研究所 技術(shù)：真菌ITS1區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序 測(cè)序平臺(tái)：454 FLX測(cè)序平臺(tái)
材料：研究者主要采集位于中國東北地區(qū)吉林省長(zhǎng)白山斜坡上的岳樺樹樹葉，采集海拔梯度從1700-2100米的6個(gè)采樣地，每個(gè)采樣地選取9個(gè)樹木樣本，每個(gè)數(shù)目樣本采集20片葉片（共1080片，6 Sites * 9 Trees * 20 Leaves）
采集方法：葉片是從每個(gè)海拔梯度中隨機(jī)選取的每棵當(dāng)年生樹木枝干的中間部分采集；樣本樹的枝干約高地面1.5m-4.5m（從海拔2076和1630m到1847和1921m）；樹木的枝干一般朝向北部，東南和西南方向；均勻采樣以減少樣本之間的差異性。
分析方法：QIIME計(jì)算alpha多樣性，SPSS比較多樣性指數(shù)差異，回歸曲線和pearson相關(guān)性，NMDS分析beta多樣性，Cytoscape繪制網(wǎng)絡(luò)圖以及R中vegan軟件包進(jìn)行差異性分析（Adonis/ANOSIM）
研究背景:
植物體內(nèi)普遍存在著內(nèi)生菌，主要包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌三大類。樹木和灌木葉片內(nèi)的內(nèi)生真菌代表了一類廣泛存在并且高多樣性的真菌類群。目前高通量擴(kuò)增子測(cè)序?yàn)檠芯筷懙刂参锝M織真菌多樣性提供了便利條件。成百上千個(gè)葉片真菌物種僅僅在一個(gè)植物中被發(fā)現(xiàn)，成千上萬個(gè)葉片真菌物種在其生長(zhǎng)本土范圍內(nèi)的單一植物種上被發(fā)現(xiàn)。然而，但是關(guān)于它們沿著環(huán)境梯度的多樣性模式仍然是不清楚的，另外關(guān)于這些復(fù)雜的內(nèi)生真菌群落在相同的宿主種中怎么進(jìn)行組合的了解也少之又少。
岳樺樹（Betula ermanii）是一種落葉闊葉物種，廣泛分布在陡峭的斜坡上或者北方的森林中，大多位于日本，俄羅斯偏東地區(qū)和中國的東北地區(qū)。研究者采集不同海拔梯度的樹木樣本葉片進(jìn)行ITS1區(qū)高通量測(cè)序，同時(shí)對(duì)葉片組織的C組成及含量和其它的物理特征進(jìn)行測(cè)量，從而用來比較不同海拔梯度葉片內(nèi)生真菌群落的alpha和Beta多樣性，以及不同環(huán)境因子對(duì)群落組成和分布的影響，并找出驅(qū)動(dòng)群落變異的主要環(huán)境因素，這些群落多樣性和組成變異可以用來反饋或者影響森林生態(tài)系統(tǒng)中的碳循環(huán)和動(dòng)態(tài)過程。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析流程圖：
研究結(jié)果：
一 數(shù)據(jù)特征
研究者總共采集了54個(gè)岳樺樹樣本（1080片葉片），對(duì)ITS1區(qū)測(cè)序分析共生真菌細(xì)菌群落，共得到1079386條序列，每個(gè)樣本序列范圍在795-81697條之間，形成了1762個(gè)OTU。研究者未去除Singletons(487條，27.64%)，因?yàn)樗鼈兛赡艽砹艘恍┫∮械奈⑸镱惾骸４送?，通過去除掉singletons得到的一些的主要結(jié)果也并沒有影響觀察到的趨勢(shì)。
與一些已有的葉片內(nèi)生真菌的研究結(jié)果相一致，所觀測(cè)到的OTU豐富度的稀釋性曲線未能接近于漸近線（Fig S1）。這可能表明了由于采樣或者序列深度問題一些稀有的內(nèi)生真菌物種沒有被觀測(cè)出。盡管如此，岳樺樹或者采樣地點(diǎn)的豐富度是可以比較的。
Fig. S1 所觀測(cè)到的OTU豐富度的稀釋性曲線
岳樺樹內(nèi)生真菌群落中子囊菌占據(jù)主導(dǎo)地位，占總序列的82.73%。此外，非雙核的內(nèi)生真菌（74條序列）類群也被發(fā)現(xiàn)（Table S1）。在1762個(gè)OTU中，15個(gè)主要的內(nèi)生真菌OTUs通過NCBI被比對(duì)出，這些序列占據(jù)了所有序列的84.57%（Table S2）。許多假定存在的一些真菌類群也在先前植物研究中發(fā)現(xiàn)，支持了它們潛在的共生能力。
Table S1沿海拔梯度岳樺樹的內(nèi)生真菌門總結(jié)
（包括序列數(shù)目；每個(gè)分類序列數(shù)目占總序列數(shù)目的百分比；每個(gè)分類單元OTUs的數(shù)目）
Table S2基于比對(duì)NCBI得到中國長(zhǎng)白山岳樺樹的15個(gè)最高豐度OTUs
二 沿海拔梯度多樣性和群落組成差異
研究者發(fā)現(xiàn)種系豐富度隨著海拔高度逐漸遞增（R2 = 0.1774，P = 0.0069），而均勻度僅僅在高海拔位點(diǎn)增加（R2 =0.6859，P < 0.0001；Fig 1）。香農(nóng)多樣性指數(shù)也隨海拔逐漸增加（R2 = 0.3733，P < 0.0001）。NMDS圖顯示內(nèi)生真菌群落隨海拔高度在逐漸變化（Fig.2A）。ANOSIM分析結(jié)果顯示不同海拔高度的內(nèi)生真菌群落有著顯著性差異（Table S3）。特別的，隨著海拔梯度升高，擔(dān)子菌門相對(duì)豐度顯著升高（Fig.3A）。
Fig. 2. 基于計(jì)算54個(gè)樹樣本×OTU矩陣得到的NMDS圖。每一個(gè)點(diǎn)（n = 54）表示單個(gè)樹樣本的內(nèi)生真菌群落。海拔梯度被制成光滑的表面，以適應(yīng)NMDS排序。
Table S3沿海拔梯度變化內(nèi)生真菌組成的差異分析
 
Fig. 3. 門水平的分類組成
觀測(cè)到的242個(gè)區(qū)分明顯的真菌屬，只有62個(gè)在所有的海拔梯度中被發(fā)現(xiàn)（Fig 4）。這些共有的位點(diǎn)屬類群作為假定存在的主要屬類群，超過所有序列的98%。此外，在每個(gè)海拔梯度上也有特異的一些屬類群，尤其在2076m海拔處，特異屬類群在242個(gè)區(qū)分明顯真菌屬中占11.98%。因此，在不同海拔梯度中的內(nèi)生真菌群落組成差異可以由主要內(nèi)生真菌物種的相對(duì)豐度差異和稀有物種的出現(xiàn)或消失來說明。
Fig. 4. OTU網(wǎng)絡(luò)圖顯示屬水平上來自不同海拔的所有樣品OUT之間的相互作用。每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)真菌屬（共有242屬）。在左欄中的屬對(duì)于一個(gè)海拔地點(diǎn)是唯一的，而右欄中的屬隸屬于多個(gè)海拔地點(diǎn)。
三 沿海拔梯度植物特征的變化
幾乎所測(cè)量植物的一半，包括樹木特征，葉片中基本化學(xué)元素成分和葉片碳組分在不同海拔梯度采樣點(diǎn)顯著變化，其中一些表現(xiàn)出明顯的劃分趨勢(shì)。岳樺樹樹高，直徑，樹蔭長(zhǎng)度和寬度和相鄰樹木密度隨海拔顯示出一個(gè)單峰趨勢(shì)（Fig S3）。10個(gè)基礎(chǔ)元素中，只有C，和Fe含量隨海拔高度變化有顯著性變化。此外，沿海拔梯度變化的四個(gè)碳組分含量有顯著性差異（Fig S4） 。木質(zhì)素含量隨海拔高度增加顯著降低，而半纖維素隨海拔升高緩慢增加，纖維素在高海拔位點(diǎn)含量顯著增加，而可溶性糖類表示出相反趨勢(shì)。
Fig. S2 5個(gè)測(cè)量的樹特征和海拔高度之間的關(guān)系
Fig. S3葉中的10個(gè)基本元素和海拔高度之間的關(guān)系
Fig. S4四個(gè)葉中的碳組分和海拔高度之間的關(guān)系
四 環(huán)境因子對(duì)內(nèi)生真菌多樣和群落組成差異的影響
研究者發(fā)現(xiàn)海拔梯度與內(nèi)生真菌多樣性和群落組成顯著相關(guān)，以及一些與海拔梯度差有關(guān)的一些植物特征變化。這些植物特征或許對(duì)所觀測(cè)到的Alpha和Beta多樣性有著一定影響。Pearson相關(guān)性分析表明，除了海拔梯度，樹木大小，樹葉化學(xué)元素和樹葉碳組分可能在不同程度上顯著影響著內(nèi)生真菌的alpha多樣性。有趣的是發(fā)現(xiàn)葉片碳組分和內(nèi)生真菌alpha多樣性指數(shù)之間有著強(qiáng)正相關(guān)作用，比海拔梯度對(duì)均勻度和香農(nóng)多樣性指數(shù)相關(guān)性更強(qiáng)。在四個(gè)碳組分中，纖維素和總碳含量對(duì)內(nèi)生真菌alpha多樣性有著相似的作用。盡管當(dāng)控制海拔梯度因子，物種豐度度和任何測(cè)量的植物特征屬性沒有顯著相關(guān)性。
此外，Mantel檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（基于Canberra距離）內(nèi)生真菌的群落組成和環(huán)境因子變異之間顯著相關(guān)（pearson相關(guān)系數(shù)從高到低排列）：海拔梯度>碳含量>相鄰樹木生長(zhǎng)密度>木質(zhì)素>纖維素>Fe含量>樹高>樹蔭寬度>樹徑。通過R中的vegan軟件包中的bioenv功能，篩選出一系列顯著相關(guān)環(huán)境因子，包括海拔梯度，碳含量，樹高，纖維素，木質(zhì)素和C/N比（Fig 2B）。當(dāng)控制海波梯度，我們發(fā)現(xiàn)葉片碳含量持續(xù)顯著影響著內(nèi)生真菌群落組成（r = 0.119, P = 0.01）。此外，樹高和樹蔭寬度與內(nèi)生真菌群落顯著相關(guān)，但是解釋貢獻(xiàn)度值在邊緣（r<0.077）。因此，盡管去除掉海拔梯度的影響，在所有的測(cè)量指標(biāo)中葉片碳含量被認(rèn)為是對(duì)內(nèi)生真菌alpha和Beta多樣性影響最為顯著的因素（Fig 5）。
Fig. 2B. 基于計(jì)算54個(gè)樹樣本×OTU矩陣得到的NMDS圖。通過R中的vegan軟件包中的bioenv功能，篩選出與整個(gè)菌落最相關(guān)的6個(gè)環(huán)境因子
Fig. 5.葉片碳含量對(duì)岳樺樹葉片內(nèi)生真菌alpha和Beta多樣性影響。左側(cè)：α多樣性指數(shù)（豐富度和均勻度）；右側(cè)：葉片碳含量NMDS分析
總體評(píng)價(jià)：
1研究者采用454測(cè)序平臺(tái)成本高，樣本測(cè)序深度低，建議使用Miseq測(cè)序平臺(tái)，可獲得更多的序列和節(jié)約成本；
2 研究結(jié)果中使用了不同的距離算法進(jìn)行群落聚類，可考慮使用相同的距離進(jìn)行比較更加合理。
關(guān)于天昊：
天昊生物采用Miseq PE250測(cè)序策略對(duì)細(xì)菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)/真菌18S rDNA區(qū)的雙V區(qū)或多種單V區(qū)進(jìn)行測(cè)序，使用低循環(huán)數(shù)擴(kuò)增，保證每個(gè)樣品擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一；采用特殊方法可有效避免系統(tǒng)內(nèi)誤差；數(shù)據(jù)質(zhì)量高，有效序列Q30達(dá)到80%以上；加上最新升級(jí)的分析內(nèi)容和解釋詳盡的結(jié)題報(bào)告，帶您享受極致的微生物擴(kuò)增子測(cè)序體驗(yàn)。
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