|
我們可利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)某個(gè)基因在特定組織中進(jìn)行表達(dá)定量。
技術(shù)方法：
在實(shí)際的研究工作中，依照不同實(shí)驗(yàn)研究的需要，我們可以根據(jù)是否加入標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)進(jìn)行絕對(duì)定量或者相對(duì)定量。目前我們主要可以通過(guò)檢測(cè)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)初始樣品的某個(gè)基因進(jìn)行定量。根據(jù)檢測(cè)熒光來(lái)源的不同，常用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR主要分為兩種，一種是通過(guò)SYBR Green I嵌入DNA雙鏈發(fā)光原理來(lái)實(shí)現(xiàn)，而另一種是通過(guò)Taqman探針來(lái)實(shí)現(xiàn)。 1） SYBR Green I SYBR Green I 是一種結(jié)合于DNA小溝中的雙鏈 DNA 結(jié)合染料，與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。在 PCR 反應(yīng)體系中加入SYBR 熒光染料后，在PCR擴(kuò)增前，由于沒(méi)有雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物DNA的存在，體系中熒光強(qiáng)度很低（雙鏈DNA模板及引物等會(huì)產(chǎn)生少量的熒光背景），但隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，體系中的雙鏈DNA不斷增多， SYBR 熒光染料會(huì)特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后發(fā)射熒光信號(hào)從而使得體系中的熒光強(qiáng)度也同步增加，增加的熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的增加成正比。 SYBR Green I 在核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)方面有很多優(yōu)點(diǎn): 1) 具有通用性，不必因?yàn)槎ㄎ换虻牟煌嗁?gòu)特別探針；2）價(jià)格相對(duì)較低；3）可以通過(guò)熔點(diǎn)曲線分析看擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，但是由于由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，因此由引物二聚體及非特異擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性。 2）TaqMan 探針 TaqMan 探針是一種特殊的寡核苷酸探針，能與待測(cè)基因片斷特異結(jié)合，其5’ 端連接一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)，而3’ 則連接有熒光淬滅基團(tuán)，因此PCR反應(yīng)前，加入的TaqMan 探針不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，但在PCR過(guò)程中，TaqMan 探針會(huì)結(jié)合到模板DNA分子上，DNA聚合酶在該DNA分子上延伸碰到結(jié)合著的TaqMan 探針時(shí)，其5’ 外切酶活性會(huì)將探針切掉，從而使熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，釋放出熒光（見(jiàn)圖IV）。體系中熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物等比例增加，這樣用體系中的熒光強(qiáng)度可以很好的代表PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量。 用Taqman探針來(lái)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增的效率具有很強(qiáng)的特異性，對(duì)于體系中引物二聚體以及非特異性條帶的產(chǎn)生不太敏感，但是Taqman探針是基因特異性的，不同基因需要訂購(gòu)合成不同的探針，因此需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的訂購(gòu)時(shí)間而且費(fèi)用也較高。事實(shí)上，Taqman探針對(duì)目的片斷擴(kuò)增的特異性檢測(cè)并非完全不受引物二聚體或非特異性擴(kuò)增的影響，在引物二聚體或非特異性擴(kuò)增發(fā)生的情況下，PCR的擴(kuò)增效率會(huì)顯著下降，從而導(dǎo)致對(duì)檢測(cè)樣本的目的基因的定量顯著偏低。  圖 VI.、Taqman 探針工作原理 應(yīng)用領(lǐng)域： 目前基因表達(dá)水平的定量研究在疾病基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)、腫瘤研究以及模式生物等多個(gè)研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。
檢測(cè)對(duì)象：
人類(lèi)血液細(xì)胞、組織細(xì)胞或者培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源的總RNA。 FFPE（福爾馬林固定石蠟包埋）組織樣品。 服務(wù)內(nèi)容：
|
